肠-脑轴的发现已经证明，大脑功能会受到肠道微生物群代谢物的影响，因此探索新的工具来调节肠道微生物群从而对大脑功能发挥作用具有重要意义。同时，工程菌作为调节宿主健康稳态的口服生物活性治疗剂在微生物治疗中引起了广泛关注。然而，这种策略是否能够在体内远程调节宿主的大脑功能尚未得到研究。本研究中，我们设计了三种蓝光响应型益生菌作为口服活性生物治疗剂。它们由上转换光遗传学微纳米系统在时空上传递和控制。这种微纳米系统促进了外源性乳酸乳球菌在肠道内靶向和产生，实现了对焦虑行为、帕金森病和迷走神经传入等大脑功能的精准操控。这种无创和实时的益生菌干预策略使得从肠道到宿主的交流更加可控，这将使工程微生物能够准确有效地调节宿主的健康。

　　L. lactis NZ9000菌株已被普遍认为是一种安全的载体，并已在微生物治疗中用作口服剂。NZ9000的生长依赖于葡萄糖的添加，这通过在存在和不存在0.5%葡萄糖的基础培养基中的生长曲线a)。为了构建蓝光响应型乳酸乳球菌，我们使用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因，将蓝光响应性启动子pDawn引入乳酸乳球菌表达质粒pNZ8148(图1a)。pDawn启动子由基于双组分系统YF1/FixJ的蓝光光传感器结构域组成，它控制阻遏物cI的表达，然后进一步调节由启动子PR驱动的GFP转录(图1b)。将重组质粒pNZ8148-GFP转化乳酸乳球菌菌株NZ9000(菌株LL-GFP)后，在黑暗条件下，GFP信号在基础水平沉默。在蓝光照射下，光照30 min后GFP强度增加了3倍，光照60 min后增加了6倍(图1c，d)。这些数据表明，工程化LL-GFP对外部蓝光照射具有快速且时间依赖性的响应。该菌株还显示出响应周期性外部蓝光的动态表达能力(图S1b)。由于乳酸乳球菌是通过口服输送到肠道的，它不可避免地会通过消化道，直接与消化液接触。这个过程会导致细菌降解，从而影响肠道乳酸乳球菌的最终数量。为了解决这个问题，最好将细菌包裹起来以防止胃降解并在肠道条件下提供靶向释放。据报道，海藻酸钠微球具有非常稳定的pH响应，并已广泛用于生物活性物质的封装和口服递送。海藻酸钠中-COO-和-COOH的电荷密度随环境pH值动态变化。由于海藻酸钠的pKa为3.4~4.4，当环境pH低于此范围时，-COO-获得质子转化为-COOH，形成固体水凝胶。当pH值升高时，-COO-之间的静电排斥力使水凝胶膨胀，导致水凝胶的破坏。此外，我们在海藻酸钠微球外加了壳聚糖壳，使微球更能粘附在肠壁上。为了帮助微系统更好地靶向小肠，将肠质子依赖性转运蛋白1(PepT1)抗体与壳聚糖混合(图1e)。通过各种跟踪剂对组分进行标记，我们可以观察到PepT1和壳聚糖位于微球的外壳中，而海藻酸钠和细菌分布在内核(图1f，g)。

　　(a) LL-GFP质粒构建示意图。(b) pDawn启动子在乳酸乳球菌中响应蓝光的示意图。(c) LL-GFP在蓝光照射下的GFP表达荧光图像。(d) c中GFP荧光强度的流式细胞术分析。(e) 海藻酸钠微球将乳酸乳球菌输送到小肠的示意图。(f)海藻酸钠微球壳聚糖层中PepT1的免疫荧光。(g)掺有各种染料的海藻酸钠微球的荧光图像。壳聚糖用DAPI(蓝色)染色。海藻酸钠用罗丹明(红色)染色，乳酸乳球菌稳定表达GFP(绿色)。

　　然后，评估海藻酸钠微球的pH响应。将微球浸入不同pH值的缓冲液中30 min，然后通过扫描电子显微镜(SEM)分析其形貌。结果表明，微球在pH 2时保持其原始直径，而在pH 8时体积膨胀(图2a)。这些结果与海藻酸钠的性质相对应。我们还证明，在通过pH 2缓冲液30 min期间，壳聚糖外壳仍然保持稳定(图S1c)。接下来，我们将乳酸乳球菌(具有氯霉素抗性)封装到微球中。在各种pH缓冲液中浸泡30 min后，将剩余的微球用氯霉素包被在M17固体培养基上。从图2b中可以看出，当用碱性缓冲液处理时，乳酸乳球菌菌落分布在微球周围。然后，首先将包裹乳酸乳球菌的微球浸入酸性缓冲液中30 min，然后转移到碱性缓冲液中30 min。将每种缓冲液的上清液涂抹在M17固体培养基上。如图2c所示，乳酸乳球菌没有释放到酸性缓冲液中，而乳酸乳球菌大量释放到碱性缓冲液中。此外，我们还检测了微球壳中的PepT1抗体是否会影响其pH响应性。结果表明，PepT1抗体不影响碱性缓冲液中的细菌释放(图2d)。这些结果表明微球对肠道pH具有良好的响应性。

　　之后，我们将传统的口服管饲法与微球将乳酸乳球菌输送到小肠进行了比较。为了实现这一点，乳酸乳球菌被CFSE-DA标记为绿色荧光，通过传统的口服管饲法或微球传递给小鼠。然后通过流式细胞术计算肠道中的细菌。高荧光基团代表外源性乳酸乳球菌。结果表明，与传统灌胃组相比，微球处理组回肠中乳酸乳球菌增加了～4倍，结肠中乳酸乳球菌减少了～1.46倍，空肠无明显变化(图2e，f)。这些数据表明，在用微球处理后，外源性乳酸乳球菌更倾向于在小肠中定殖。然后我们分析了小肠中的外源细菌数量。取小肠内容物，经灌胃或微球给药后，采用菌落法定量乳酸乳球菌(图S1d)。这些数据表明，这两种方法都不能保证乳酸乳球菌的永久定殖，这与外源性细菌很难与共生肠道微生物群竞争的事实相一致。然而，微球可以帮助乳酸乳球菌停留更长时间。然后，我们用各种染料标记微球中的成分，以追踪它们在肠道中的分布。与上述结果一致，我们观察到接受PepT1微球的小鼠回肠中海藻酸钠沉积显著更高(1.3倍)，而结肠中海藻酸钠沉积显著降低(0.8倍)(图2g)。总体而言，这些结果表明，用PepT1将乳酸乳球菌包裹在微球中可以增强乳酸乳球菌向小肠的靶向输送。

　　(a)海藻酸钠微球在各种pH缓冲液下的扫描电子显微镜(SEM)结果。将海藻酸钠微球浸入酸性pH缓冲液(pH=2)或碱性缓冲液(pH=8)中30 min。(b)海藻酸钠微球在酸性缓冲液(pH=2)或碱性缓冲液(pH=8)中释放乳酸乳球菌。(c)海藻酸钠微球体外释放乳酸乳球菌，模拟体内消化道的pH值。(d)海藻酸钠微球中乳酸乳球菌的释放响应于各种pH值。在两组pH=8中P=0.0315。(e) CFSE-DA的流式细胞仪谱标记了海藻酸钠微球的乳酸乳球菌和传统的口服管饲法。(f) e的统计分析。通过双尾Students-t检验确定统计显著性(空肠P=0.23；回肠**P=0.0021；结肠*P=0.0047)。数据代表每种条件下三只小鼠的平均值和标准偏差。(g)小鼠空肠、回肠和结肠肠段中海藻酸钠微球(有或没有PepT1)分布的荧光可视化。肠细胞用DAPI(蓝色)染色。海藻酸钠微球的壳聚糖用钙黄绿素(绿色)染色，海藻酸钠核用罗丹明(红色)染色。白色虚线表示肠的ektexine。放大图像显示回肠中PepT1组的细节。统计显著性由双尾Students-t检验确定(回肠**P=4.87×10-5；结肠**P=3.36×10-5)。数据代表三个重复的平均值和标准偏差。

　　如何将可见光传递到体内深部肠腔以帮助对光敏感的乳酸乳球菌感知光是另一个问题。传统方法在肠道附近植入光纤，这通常会导致不可逆的组织损伤。或者，稀土上转换材料可以将长波长NIR光转换为短波长可见光。由于已知长波长光比可见光具有更强的组织穿透能力，上转换材料特别适用于深部组织应用，已广泛与传统光遗传学操作相结合，用于许多生物学调控。在这种思想的指导下，我们尝试使用上转换光遗传学来调节深层组织的细菌活性。已成功合成了长度约1.5 μm的铥(Tm)上转换棒状上转换材料(UCR)，其在980 nm光的激发下发出475 nm蓝光(图3a、b和图S2a)。UCR由无机元素组成，对活细胞有严重的毒性。在体内应用时，我们需要考虑材料如何安全地在动物身上发挥作用。为了解决这个问题，在紫外光固化后，使用光聚合微粒将UCR封装到PEGDA水凝胶中，形成上转换微滴(UCM)。UCM的直径约为150 μm(图3c和图S2b，c)。这种圆形微粒有望通过口服给药输送到肠道。

　　然后，对UCM的安全性进行了调查。由于UCM内部的紧密交联，微粒在浸入模拟肠道缓冲液后至少保持稳定30天(图S3a)。使用吲哚菁绿(ICG)作为指示剂，将ICG封装的UCM(UCM-ICG)浸入各种缓冲液中，并且没有ICG从UCM泄漏到上清液(图S3b)。在近红外光照射60 min后，UCM也没有ICG泄漏(图S3c)。这一特性保证了UCM在肠道环境中的pH值和光稳定性。接下来，我们测试了UCM与NIR光照是否可以在体外培养的LL-GFP中诱导GFP表达。UCM与LL-GFP共培养，NIR光(2 mw/mm2)在培养底部外照射。不同光照时间下GFP的表达与蓝光诱导效应具有相似的趋势(图3d)。这些结果表明UCM和NIR光处理能够诱导LL-GFP中的基因表达。值得注意的是，该系统还表现出荧光信号的可逆性，以响应以2 h间隔循环的980 nm激光照射(图S4a)。细菌生长曲线还显示蓝光和近红外光对细菌生长无明显影响(图S4b)。

　　为了探索灌胃后光照的优化时间，我们使用体内成像来跟踪UCM在消化道的移动路径。通过追踪UCM-ICG，我们发现灌胃后3～4 h，UCM在小肠内聚集的含量最多，20 h后微粒可随粪便排出体外(图3e和图3e)。考虑到频繁治疗对小鼠的副作用，我们将灌胃后4 h作为光照的最后时间点。此外，管饲后没有物质泄漏到其他器官(图S5b)。这些数据表明UCM在小鼠肠道中具有良好的稳定性和安全性。肠道中的病理学结果还表明，接受UCM+NIR光处理的小鼠未显示出可观察到的组织损伤(图S6a-d)。这些评估表明UCM的生物相容性和生物安全性。另外，体内成像显示了细菌(以表达luxABCDE的大肠杆菌为代表)和UCM-ICG(图S6e)的共定位，支持了该系统在体内应用的可行性。

　　最后，我们测试了该系统是否可以在小鼠肠道中诱导GFP表达。为此，小鼠肠道预先用LL-GFP定殖，然后通过口服管饲法将UCM输送到肠道。4 h后NIR光照射剃毛小鼠的腹部。NIR照射30 min后，取出肠道内容物进行GFP分析。从图3f和图S6f可以看出，在空肠和回肠，与暗处理组相比，UCM和NIR光处理组可以观察到明显的荧光峰。此外，在部分小肠段中，近红外光和蓝光处理组的GFP表达相当。考虑到可见光对宿主的副作用以及可植入光纤到组织的缺点，我们使用上转换光遗传学纳米系统作为替代光源。

　　(a) UCR的扫描电子显微镜(SEM)。(b) 980 nm激光激发蓝色发光UCR的发射光谱。(c)使用明场和荧光显微镜对UCM进行可视化。(d) FACS点图表示UCM+NIR光或UCM+蓝光照射下的GFP荧光。(e)在不同时间点后用UCM-ICG治疗的小鼠的体内成像。(f) FACS点图表示用UCM+NIR光或UCM+蓝光处理30 min的小鼠肠道内容物中的LL-GFP表达。每个实验至少重复3次，结果相似。

　　据报道，口服GABA可以缓解小鼠的焦虑样行为。为了使用基于微生物的肠-脑轴调节来实现对焦虑的精确调节，乳酸乳球菌被设计为在光照下产生GABA。我们首先编译了一种分泌GABA的乳酸乳球菌菌株(LL-GABA)，该菌株在NIR光和UCM触发条件下产生GABA以实现GABA的时空表达。两个对GABA产生至关重要的基因被插入到pDawn启动子的下游：催化从谷氨酸(Glu)转化为细胞内GABA的谷氨酸脱羧酶gadb和将GABA运输出细胞的Glu-GABA反转运蛋白gadc (图4a)。LL-GABA显示出对上转换光遗传学纳米系统的时空响应，随着近红外照明时间的延长而增加(图4b)。为了验证培养基中GABA积累的产生是由于gadb和gadc基因，我们设计了另一种不能产生GABA的菌株(LL-ΔGABA，gadb基因中有碱基缺失)。结果表。